In seguito, alla tragica scomparsa del Savonarola, questa nuova repubblica si mostrò sempre più debole e ciò si rese evidente soprattutto durante la guerra per la riconquista di Pisa (1509). In seguito ci fu il ritorno dei Medici che mantennero il potere fino al 1527, quando furono nuovamente cacciati.
Avvenne per un volta faccia da parte di Clemente VII, secondo papa Medici nei confronti dell'imperatore del Sacro Romano Impero Carlo V° con il quale era alleato; Clemente VII non reputando più conveniente per la sua casata l'alleanza con l'imperatore, si alleò con la Francia di Francesco I. Questo causò le ire di Carlo V che per vendicarsi lanciò i suoi Lanzichenecchi su Firenze e Roma seminando la rovina.
Fu per questo che i Medici vennero ricacciati per la seconda volta da Firenze, facendovi ritorno solo 3 anni dopo. Divennero duchi di Firenze nel 1532 e nel 1569 granduchi di Toscana con COSIMO I (vedi sopra il busto).
Alla morte di Cosimo I, avvenuta nel 1574, le redini del granducato passarono al figlio Francesco I, quest'ultimo si distinse più che per le sue doti politiche per una grande passione per le arti e per l'alchimia; grande mecenate: protesse infatti numerosi artisti tra i quali il Buontalenti e il Giambologna ai quali commissionò la realizzazione della magnifica villa (oggi purtroppo non più esistente) e dell'altrettanto magnifico parco di Pratolino (oggi parco Demidoff), per la sua amante Bianca Cappello, poi successivamente sua 2° moglie, insieme ed altri palazzi in Firenze.
Dal suo primo matrimonio con Giovanna d'Austria, ebbe tre figli: un figlio maschio morto molto piccolo, Eleonora futura duchessa di Mantova (sposa nel 1584 Vincenzo I Gonzaga) e Maria futura regina di Francia (sposando nel 1600 Enrico IV° Borbone).
Nel 1587 Francesco I e Bianca Cappello morirono misteriosamente nello stesso giorno nella villa di Poggio a Caiano, colpiti ufficialmente dalla malaria, ma fu ventilata l'ipotesi del veleno; in questa faccenda non sembrava estraneo il fratello del granduca il cardinale Ferdinando poi divenuto granduca Ferdinando I, ma la cosa fu messa a tacere e rimane a tutt'oggi avvolta nel mistero.
Dopo l'improvvisa morte di Francesco I e Bianca Cappello, divenne dunque, granduca Ferdinando I, egli a differenza del fratello si distinse per le sue spiccate doti politiche e diplomatiche, attuando una politica filo-francese ( fu lui infatti a dare in sposa al re di Francia la nipote Maria); a differenza del fratello Francesco I che invece aveva intrapreso una politica filo-spagnola. Con il regno di Ferdinando primo volgiamo così al XVII secolo, dato che la sua morte è avvenuta nel 1609.
Nel 1609, diviene granduca di Toscana Cosimo II, più che per le sue doti politiche o per il suo grande interesse per le scienze, va ricordato come un grande mecenate, in questo campo tra i suoi protetti anche il grandissimo Galileo Galilei che dedicò la scoperta dei satelliti di Giove al granduca stesso, chiamandole Lune Medicee. Cosimo II di salute molto fragile, morì prematuramente a 31 anni nel 1621. Nello stesso anno diviene granduca Ferdinando II, dotato di discrete capacità politiche e diplomatiche, anche lui amante delle scienze. Come il padre protesse il Galilei. Nel 1633 a seguito della condanna al rogo di quest'ultimo per eresia, non potendo niente il granduca per evitare l'abiura e la cessazione della divulgazione scientifica richiesta dal Papa da parte dello scienziato, Ferdinando II fece in modo che il pensiero Galileiano si diffondesse ugualmente, fondando con il fratello cardinale Leopoldo l'accademia scientifica del Cimento della quale facevano parte molti allievi del grande scienziato, fra cui Francesco Redi. Ferdinando II era egli stesso studioso e scienziato e perfezionò molti strumnti scientifici come il termometro.
Ferdinando II morì nel 1670 e gli succedette il figlio Cosimo III che fece ben presto rimpiangere ai fiorentini la bonaria liberalità di suo padre; egli infatti, era molto bigotto e con lui ben presto Firenze si riempì a dismisura di preti e di monache e una cappa opprimente di finto perbenismo si abbatté sulla città. Cosimo III sposò nel 1661 Margherite Louise d'Orleans, cugina di Luigi XIV°. Fu un matrimonio disastroso a causa dell'incompatibilità di carattere che vi era fra i due, tanto serio e bigotto lui, tanto estrosa lei che possiamo anche considerare una trekkers ante litteram: infatti lei era solita compiere lunghe passeggiate nella campagna fiorentina sfiancando le dame e le cameriere a seguito. Da questo matrimonio nacquero il granprincipe Ferdinando, Anna Maria Luisa (la principessa Palatina) e Gian Gastone (l'ultimo granduca).
Il granprincipe Ferdinando era destinato a divenire granduca, ma la sifilide se lo portò via prematuramente senza eredi. Egli era appassionato di musica, mecenate di grandi musicisti e musicista egli stesso, i suoi contemporanei lo dicono anche grande clavicenbalista e coinvolto insieme a Cristofori e Alessandro Scarlatti nell'invenzione del pianoforte. Il grande musicista Scarlatti era tra i protetti e grande amico del granprincipe, alcune loro corrispondenze sono giunte fino a noi.
Nel 1723 il lungo regno di Cosimo III finisce con la sua morte, gli succede il terzo figlio Gian Gastone che spazzò via la cappa oprrimente religiosa che con suo padre si era abbattuta su Firenze, portando un aria di rinnovamento e con lui iniziò quella politica rinnovatrice che poi sarà proseguita dai Lorena anche se inspiegabilmente solo quest'ultimi si prenderanno i meriti, mentre lui Gian Gastone passerà alla storia solo per essere stato un depresso.
Nel 1737, con la morte dell'ultimo granduca Gian Gastone De' Medici, la famiglia si estinse. Amanti dell' arte e delle cose belle i Medici durante i 300 anni del loro regno hanno lasciato sia a Firenze che nelle campagne come nel Mugello da dove loro provenivano, splendidi edifici: ville, giardini,conventi e capelle.
